Animal Research: Sampling

動物研究2：

分析生理/社會性別如何交互作用

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議題

生理性別是可以用來分類數據並解釋異質性疾病結果的基本變項。雖然有很多因素可能影響結果，但生理性別是進化上根本的，且會影響整個族群。在不同的學科，當他們外推結果的數據從一個生理性別到另一個時，研究人員就有可能有推斷出錯誤結論的風險。

2015年6月，美國國立衛生研究院（NIH）發布了將生理性別視為脊椎動物和人類的變項之準則（NIH, 2015; Clayton & Collins, 2014）。這跟隨加拿大衛生研究院 （2010; Johnson et al., 2014） 和歐盟委員會 （2013） 實施的促進基礎研究中生理性別／社會性別分析的政策 。我們期待美國國家科學基金會（NSF）和歐洲研究委員會（ERC）將於任何以人類為最終關懷的領域的生命科學和工程中效仿（Schiebinger & Klinge, 2015; Schiebinger, 2014）。

美國國家科學基金會資助的研討會在斯坦福大學舉行（2014年9月），以構思如何以最佳方式：1）包括雄性和雌性動物（主要是囓齒動物）到生物醫學研究，以及2）在臨床前研究中分析生理性別和社會性別 （Klein et al., 2015）。本個案研究聚焦在囓齒動物研究中方法論的創新。

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議題
方法：在動物研究中分析生理性別與社會性別如何交互作用
方法 1：分析生理性別
方法 2：交織性研究方法
方法 3：分析生理性別與社會性別如何交互作用
 

議題

除了生殖生物學和免疫學，雌性在動物研究中的大多數子領域未享有充分代表性。重要的是，該動物生理性別在22-42％的神經科學、生理學和跨學科的生物學期刊的文章中未提報 （Beery et al., 2011）。這是研究經費的浪費，如果生理性別未被提報，則數據不能被包括在後設分析中。

方法：在動物研究中分析生理性別與社會性別如何交互作用

我們當如何設計最好的動物研究，將社會性別（社會文化或環境因素與效應）及交互作用的生理性別（生物特徵）納入考慮？下圖顯示生理性別和社會性別在整個囓齒動物的生命週期中複雜的相互依賴性。

sex and gender interact

方法：分析生理性別

  • 1.在生理性別差異被排除前，必須予以追究。
  • 2.研究可以逐步進行。雄性和雌性動物應是品系（或品系和基因型）與年齡匹配的，並在相同條件（籠、墊料、飲食）下飼養。雌性不應是育種者，除非顯型評估有需要。
    • 步驟1. 總樣本大小（基於檢定力的計算）：採取同時使用雌、雄動物或細胞的策略似乎很可能檢測得到至少一些因生理性別差異而有的影響，也就是那些研究人員可能最想要檢測到的，而且對樣本大小或成本沒有任何影響。
    • 步驟2. 基於生理性別的檢定：雄性和雌性兩者的測試假設，並且檢定每一個，以判定效應。
    • 步驟3.不同生理性別之間的對比：檢定力研究，以判定實際的「生理性別的效應」。生理性別效應的檢測有財務成本；然而，已被證明的性別差異證明特定生理性別的研究之正當性，因為一種生理性別的損害對社會和個別病人是昂貴的。總體來說，相較於更昂貴的臨床試驗階段，在基礎科學階段瞭解生理性別較為便宜。這可能會降低藥物開發展的失敗率，也有利於公司避免由於對某一生理性別有害事件，而被迫從市場上移除藥品。
  • 3.為評鑑生理性別效應是否存在，研究人員還應該評估群組之間的重疊（雄性和雌性之間的相似性）和群組內的差異（雄性或雌性之中的差異）。應避免過度強調生理性別差異。
  • 4.發現沒有生理性別效應作用也應報告。為了減少發表偏倚，當生理性別差異（主要或相互作用效應）未被檢測到，或關於生理性別差異的數據在統計上是不能判定的，研究者皆應該報告（Wizemann, 2012）。報告為零的結果對後設分析至關重要。

對於不顯示生理性別差異的顯型，未來的實驗應包含生理性別，亦即包括相等數量隨機選擇的雄性和雌性，來做每次研究的測試群組。不是每次實驗都需要設計評估生理性別差異；然而，對於每一個實驗，動物測試對象的生理性別應當註明在文章中，並且報導於研究方法章節，以確保實驗是可複製的，以及研究結果（在一個生理性別中）沒有過度廣義化（到另一生理性別）（Wizemann, 2012）。

見總方法

 

方法：交織性研究方法

  1. 考慮到動情週期 （Byers et al., 2012）
    1. Becker等人（2005）的研究建議，研究者記錄動情週期的階段：測試可包括兩組在動情週期的兩個特定階段的雌性大鼠，或四組的雌性，分別代表該週期的4天。Becker等人的研究告誡，不要隨機測試在動情週期的雌性，因為因動情週期而變化的生理性別差異可能會忽視掉。他們還警告，密切接觸的一小群雌性，其週期可能同步化，導致研究人員錯失隨週期發生的變化。
    2. 在近10,000個表徵的後設分析中，Prendergast等人（2014）的研究發現，對於大多數生物的測量，雌性並不比雄性更可變。其他因素──包括群體對比單獨籠養──可能對一個表徵的變化之影響，比對動情週期各階段的更大。
  2. 停經模型

    3. 更年期是動物模型研究的新興領域。一項研究報告說，免疫變化伴隨著這種荷爾蒙過渡。切除卵巢的小鼠經歷「急性停經」，並且表現出「減少的淋巴細胞趨化性、促分裂原誘導的T細胞增殖反應、以及[白介素2]的生產」（Marriott et al., 2006）。

  3. 懷孕或假孕

    4. 自1980年起，獲得美國食品和藥物管理局核准的藥物中，不到10％有足夠的資訊，用以判定出生缺陷的風險 （Adam et al., 2011; Mishra & Mohanty, 2010）。用來評估藥物安全的動物新研究應該評估懷孕和哺乳期間對母畜和胎兒的效應（McDonnell-Dowling & Kelly, 2015）。

  4. 藥代動力學

    5. 動情週期也可能影響藥物代謝動力學。Kulkarni等人（2012）的研究發現，金雀異黃酮的口服生體可用率──具有抗氧化性能的大豆異黃酮──是與雌激素水準（調節肝的藥物處置）成反比的。

什麼時候實驗可以只在單一生理性別中做？

  1. 研究特定生理性別專屬的現象時，如卵巢癌或前列腺癌。
  2. 為了解決公佈的特定領域中某一生理性別的數據的不恰當性。
  3. 有強烈、統計上穩健的證據表明，生理性別不影響表徵或結果。

某種單一生理性別佔多數的疾病，如乳癌，兩性可能仍都需要包括在內，但研究人員可能選擇不使用相等的生理性別人數。當對雄性及雌性有極大差異的疾病，但動物模型已經制定了只有一種生理性別，事情就變得更加複雜。例如，高血壓囓齒動物模型不能準確地反映雌性心臟病的生理。這些情況下，需要建立新的模式。

方法：分析生理性別與社會性別如何交互作用

integrating sex and Gender into Animal research

動物研究包括生理性別（生物特性，如基因、荷爾蒙、年齡、生殖階段，品系等）和社會性別（社會文化或環境的過程，如籠飼做法、研究人員的態度和行為、室溫、飲食等）之間的交互作用。雙端箭頭代表生理性別和社會性別之間的交互作用。

社會性別與生理性別交互作用，反之亦然。環境的過程可能對雄性和雌性動物有不同影響，如籠飼做法或分類處理。這些處理可能包括社會性別。當效應事實上取決於環境條件時，研究人員不應認定它取決於生理性別（或生物特性）。

見總方法

 

具有可能的社會性別要素的環境過程包括：

  • 1. 籠飼：個別對比群體？
    • a. 為了避免攻擊性行為，雄性囓齒動物通常關在小團體或獨處。單獨收容的囓齒動物「消耗更多的能量於維持體溫，這可能會導致如熱量攝入、肌肉活動、代謝率、脂肪分佈、或身體尺寸上的參數差別，因而有身體和細胞活性的潛在下游效應之多血症」（Ritz et al., 2014）。相反的，雌性囓齒動物更經常一起收容，以降低成本。一起住宿的囓齒動物經常集群睡眠，因此，消耗更少的能量來保暖。這種情況下，「生理性別差異」可能確定了，但其實差異是來自不同收容條件的結果。
    • b. 相同大小的群組可能為雌性與雄性造成不同的壓力源。單獨籠飼本身就可能造成壓力（Ritz et al., 2014），但單獨寵飼不論對雄性或雌性都降低表徵變異性 （Prendergast et al., 2014）。
    • c. 群組籠飼也可能導致自我誘發的或社會性掉毛，也稱為動物間相疏毛 （Kaleuff et al., 2006）。動物間相疏毛：1）通常反映同性群組籠飼的社會等級（包括雄性和雌性）; 2）可能是由於過度擁擠的壓力； 3）發生在育種群組（雌性使雄性掉毛）；和4）出現哺乳囓齒類動物（幼子使母親掉毛）之間。動物間相疏毛發生在一些品系較多於其他品系。
    • d. 籠子的大小可能限制動物的行為。例如，許多籠子不能容納所有種類的雌性性行為。在野外，雌性可能飛奔、趨近、及勾引雄性 （Birke, 2011）。由於這些原因，文章應具體說明收容條件，包括每籠動物的數目。Prendergast等人（2014）的研究發現，他們調查的小鼠研究超過一半沒有這樣做。
  • 2. 研究員／人員
    研究員／人員的生理性別：當壓力是顯著因素時，實驗者可能是囓齒動物研究的混淆變項。一項研究發現，相較於空的房間，在雄性實驗者在場情況下大鼠和小鼠顯現降低的疼痛反應，而雌性實驗者的存在沒有產生差異。雄性和雌性的老鼠都顯現這種反應，但雌性囓齒動物有較大的效應。研究人員認為這種「雄性觀察者效應」等同於對雄甾烯酮和雄甾二烯酮（發現雄性比雌性有更高濃度的腋下分泌物）的反應。除了壓力誘發的痛覺缺失之外，這些化合物的存在增加了血漿皮質酮的濃度（Sorge et al., 2014）。
  • 3.處理
    對照囓齒動物應進行像上述實驗囓齒動物之類似的壓力程序，如假手術。取陰道抹片建立雌性囓齒動物發情週期階段，可能是有壓力的；雄性囓齒動物應該以相似的方式處理（Becker et al., 2005）。如果沒有這些壓力反應的對照差異，其他的生理性別差異可能被誤認。
  • 4.晝夜循環
    睾酮隨季節和晝夜節律變化。相似地，雌性激素濃度可能在動情週期的一天過程中波動。下丘腦─垂體─腎上腺（HPA）分泌物輪流影響性腺的分泌物，也在一天的過程中變化（Becker et al., 2005）。研究人員應具體說明族群的光照期，以及進行測量的日期、時間。
  • 5. 社會動態
    Edelman等人（2013）的研究發現，大鼠懷孕行為促成青少年之間在遊戲中的生理性別差異。除了正常的母性照顧之外，模擬的母性減少雄性的梳洗，對雌性則沒有減少。這種效應可能通過增加的血清素信號促成，因為母體舌頭的舔舐也增加血清素受體的mRNA。
  • 6. 溫度
    實驗鼠通常收容在低於它們的熱中性區。Gaskill等人（2009） 研究發現，當小鼠能夠在三個籠子中的不同溫度下移動，兩種生理性別的小鼠都優先選擇溫暖環境來進行緩慢和維護性質的行為（沒有偏好活躍行為）。雌性偏好最高溫度；雄性在中、最高溫度之間沒有顯示偏好。就像日間長度，研究群體中的環境溫度應一貫地報告。
  • 7. 飲食
    飲食影響體重增加、代謝、激素濃度和免疫功能，因此應報告飼料配方（Bhupathy et al., 2010; Luczak et al, 2011; Madhusoodanan, 2022）。Glover等人（2006）的研究發現，植物雌激素豐富的飲食可能對心臟健康有特定生理性別效應。在雄性，大豆為基礎的飲食顯著地降低心臟功能，增加肌肉細胞混亂，並增加了β-MyHC──與心臟衰竭有關的肌凝蛋白原馬達蛋白。後面這種影響也能在雌性中觀察到，但程度較輕。
  • 8. 行為
    動物物種表現出顯著的行為差異可能影響研究結果。動物的行為是由遺傳、經驗和社會背景形塑的。STRANGE框架建議採用以下因素來提高研究之間的普遍性和比較：社會背景（social background）、易捕性和自選（trappability and self-selection）、飼養歷史（rearing history）、適應和習慣（acclimation and habituation）、反應能力的自然變化（natural changes in responsiveness）、基因組成（genetic make-up）和經驗（experience）（Webster & Rutz，2020）。

分析生理性別和環境—以及它們如何交互作用—對增加動物模型的轉化價值是重要的。開發藥物的成本範圍在3.5億美元至50億美元之間，而且95％的候選藥物會失敗（Arrowsmith 2011; Herper, 2013）。包括生理性別和社會性別作為研究變項可能有助於降低這些成本，促進疾病機制的發現，並拯救生命。

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參考資料

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percentage of research using male vs female animals

動物研究包含生理性別（像是基因、賀爾蒙、年齡、更新週期、壓力等等生物特性）與牽涉到社會文化或環境的研究過程（像是籠養的實施方式、研究人員的態度和行為、室溫、飲食等）之間的交互作用。右圖中，雙向箭號代表動物生理特性與實驗室環境因素之間的交互作用。牽涉到環境的研究過程，像是籠養的實施方式或具差異的管理（當中可能包含研究人員的社會性別預設與實踐），亦可能對雄性或雌性動物造成不同的影響。當某效果事實上會受到環境（實驗室）條件影響時，觀察員不應該只依靠生理性別（或生物特徵）來驗證。

最適合用來說明的例子即是研究人員的生理性別。這個例子將重點置於實驗室中的疼痛實驗。研究人員誘發大鼠與小鼠的疼痛，發現大小鼠皆不會對男性研究人員顯露出疼痛。與無人在房間的情況相較之下，當一名男性在同一個房間裡時，動物不會顯露出疼痛；但是當一名女性在房間裡時，動物們就會顯露疼痛。研究人員將此情況辨別為「男性觀測者效應（male-observer effect）」。

這是怎麼回事？造成上述情況並不是源自於研究人員的行為舉止或者對待動物的方式，而是動物聞到了男性的賀爾蒙。根據McGill大學的Jeffrey Mogil，這樣的現象可能將過往所有疼痛實驗的結果打上一個問號。